Põhipunktid rakukultuuride krüopremeerimiseks

Põhipunktid rakukultuuride krüopremeerimiseks

Rakud jätkavad metabolismi normaalse kasvutegevuse ajal, mis nõuab erinevate proteaaside osalemist. Kui temperatuur langeb alla -70 ° C, lakkavad proteaasid tööst. Seetõttu võivad rakud äärmiselt madala temperatuuriga keskkonnas peatada oma ainevahetuse aktiivsuse ja siseneda seisvasse olekusse, mis võimaldab pikaajalist säilitamist.

1. Eksperimentaalsed materjalid

Alusmaterjal:

Põhikultuuri meedium

Seerum (tavapärane FBS/NBS)

Ülipuhane tööpink

Steriilne dimetüülsulfoksiid (DMSO)

Steriilne PBS fosfaatpuhvri soolalahus

Pipeteerimispüstol

Elektriline pipeteerimispüstol

Katsete ettevalmistamine

a) Külmutuslahenduse ettevalmistamine:

Üldised rakud: 55% basaalkeskkond + 40% veise seerum (FBS/NBS) + 5% DMSO

Elutähtsad rakud: 90% veise seerum (FBS/NBS) + 10% DMSO

Alikvoot Valmistatud krüoperioodilahus 15 ml tsentrifuugi tuubi [pesa] ja hoidke hilisemaks kasutamiseks temperatuuril 4 ° C.

b) rakkude ettevalmistamine külmutamiseks:

Enne rakkude külmutamist valige hea kasvu olekuga rakud ja logaritmilises kasvufaasis ning asendage need värske söötmega 12–24 tundi enne külmutamist, et säilitada raku seisund.

2. Eksperimentaalne protseduur

1. Jälgige külmutatud rakkude tihedust, mis on umbes 80%~ 90%. Vana söötme aspiratsiooniks kasutage pipetipüstoli, lisage rakkude 1-2 korda pesemiseks steriilsed PBS ja eemaldage ülejäänud keskkond kultuurikeskkonnas.

2. Lisage sobiv kogus trüpsiini või seedimismahla, et trüpsiin saaks rakkudesse siseneda, ja asetage need seedimiseks inkubaatorisse. Jälgige mikroskoobi all olevate rakkude seisundit: tsütoplasma tõmbub tagasi ja rakud pole enam lehtedeks ühendatud. Sel hetkel lisage seedimisprotsessi peatamiseks stopplahendus.

3. Muinige rakud õrnalt otsaga, et moodustada rakususpensioon ja tsentrifuugiks raku suspensioon kiirusel 1000 p / min 3-5 minutit.

Visake supernatant ära, lisage sobiv kogus külmumislahust ja õrnalt pipeti, et lahtrid loendaksid ühtlaselt. Reguleerige raku tihedust krüoperioodiga, et saada lõplik tihedus 5 × 106/ml ~ 1 × 107/ml.

4. Kasutage pipetipüstoli, et eraldada krüogeensed torud vastavalt eeldatavale võimsusele, ja kasutage automaatset katmismasinat korkimiseks ja tihendamiseks.

5. Standardne krüoperioodiprogramm on jahutuskiirus -1 ° C kuni -2 ° C/min ja külmutatud rakke saab järk -järgult külmutada vastavalt järgmistele sammudele: toatemperatuur → 4 ° C (20min) → - - 20 ° C (30min) → -80 ° C ° C (üleöö) → pikaajaline ladustamine vedelas lämmastikus.

Seda saab salvestada ka otse sügavkülmikus temperatuuril -80 ° C üleöö ja seejärel viia ladustamiseks vedelasse lämmastikku.

Yongyue Medical on kõrgtehnoloogiaettevõte, mis on spetsialiseerunud teadus- ja arendustegevuse, biomeditsiiniliste tarbekaupade tootmisele ja müügile. Pipeti näpunäited, pipetid, PCR -plaat, rakukultuuri tooted ja muud bioloogilised laboratooriumid. Yongyue Medical on väärt teie usaldust ja valikut! Tere tulemast nõu pidama!